TRANSPLANTASI GEN-TEKNIK PLASMID

Bioteknologi dalam rekayasa genetik

Vektor, berupa plasmid bakteri atau viral ADN virus.

Bakteri, berperan dalam perbanyakan plasmid melalui perbanyakan bakteri.

Enzim, terdiri dari enzim RESTRIKSI (pemotong plasmid/ADN) dan enzim LIGASE (penyambung ptongan-potongan ADN)

Langkah-langkah dalam rekayasa genetika untuk memproduksi insulin dalam Teknik Plasmid adalah sebagai berikut :

1. Masing-masing gen polipeptida alfa dan beta disintesis secara kimiawi.
2. Gen tersebut disisipkan pada plasmid E. coli yang direkayasa supaya memiliki operon laktosa, yaitu promoter, operator, dan gen struktural 2 yang mengkode ß-galaktosidase. Di samping itu, plasmid ini juga mengandung gen yang mengkode resistensi terhadap amfisilin yang berguna sebagai marker untuk menyeleksi sel yang mengandung plasmid.
3. Masing-masing gena alfa dan beta disisipkan ke dalam plasmid yang terpisah, yaitu pada bagian kanan gen z.
4. Plasmid tersebut lalu dimasukkan ke dalam sel E. coli untuk diekspresikan.
5. Ekspresi operon laktosa akan menyebabkan terbentuknya protein galaktosidase dan protein insulin yang saling berikatan hingga membentuk protein gabungan.
6. Selanjutnya protein gabungan ini dimurnikan lalu dipotong sehingga protein insulin terpisah dengan protein ß-galaktosidase.
7. Dengan cara ini akan diperoleh polipeptida alfa maupun polipeptida beta insulin.
8. Akhirnya polipeptida alfa diikatkan dengan polipeptida beta secara oksidasi. sehingga diperoleh insulin yang utuh dan siap untuk digunakan.

DETAIL

• Dalam pembahasan tentang teknik-teknik bioenginering istilah-istilah macam plasmid dan episom tentu kita harus tahu secara mendasar
• Sesungguhnya apa dan bagaimana sih plasmid itu ?

Dalam coretan catatan ini, secara ringkas akan diperjelas tentang hal teknologi bioteknologi yanng melibatkan Plasmid:

• Plasmid merupakan molekul DNA tambahan atau elemen DNA ekstra kromosomal.
• Plasmid berada di sitoplasma bakteri berupa DNA sirkuler ekstra kromosomal

• Episom merupakan unsur-unsur genetik bebas yang telah dapat berkembang dalam sel bakteri baik dalam keadaan autonom (menggandakan diri dan dipindahkan tanpa bergantung kepada kromosom bakteri) maupun pada keadaan terintegrasi (melekat pada kromosom bakteri
• Episom ini berperan serta bersamanya dalam rekombinasi genetika dan dipindahkan bersama kromosom bakteri tersebut.

• Baik Plasmid maupun episom memiliki fungsi yang penting dalam penelitian genetika maupun dalam perekayasaan gen.
•  
• Plasmid memiliki struktur yang sama dengan DNA kromosom yang terdiri atas gen-gen yang mengkodekan sifat tertentu seperti resistensi terhadap antibiotik dan sebagainya.
• Plasmid memiliki bentuk sirkular untai ganda (umumnya), sirkular untai tunggal seperti pada bakteri gram positif dan berbentuk linier seperti pada genus Borellia dan Streptomyces.OK

• Plasmid melakukan replikasi sendiri dan memiliki dua tipe yaitu plasmid berukuran kecil (kurang dari 10 kb) dan terdapat dalam kopian berganda di dalam sel dan plasmid F yang berukuran lebih besar (lebih besar dari 30 kb; plasmid F sendiri berukuran 100 kb).
• Plasmid ini hanya memiliki satu atau dua kopian per sel. Plasmid F ini juga dikenal dengan plasmid konjugativ karena dapat ditransfer dari satu sel ke sel yang lain atau dapat menggabungkan dirinya ke dalam kromosom.

• Pengertian Plasmid dan Episom
• Pengertian Plasmid secara gamblang, Dale & Park (2004) menyebutkan bahwa plasmid merupakan molekul DNA tambahan atau elemen DNA ekstrakromosomal.
• Dalam Garner (1991) diterangkan bahwa plasmid merupakan replicon (sebuah unit dari materi genetik yang mampu melakukan replikasi secara mandiri) yang diwariskan secara stabil (dipertahankan tanpa seleksi tertentu) dan berada di luar kromosom (extra-chromosomal).

• Plasmid hanya dimiliki oleh organisme prokariot dan tidak dimiliki oleh organisme eukariot.
• Namun karena plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal, maka kromosom otonom seperti pada mitokondria dan kloroplas pada sel eukariot sebagian menganggap itu merupakan plasmid karena kromosom sebenarnya terdapat pada inti.
• Plasmid bakteri secara umum berada di dalam sel sebagai molekul DNA sirkular dengan penyesuaian yang sangat rapi, berkaitan dengan bentuk supercoil dari DNA.
• Pada beberapa kasus, plasmid merupakan molekul yang sangat kecil dengan panjang hanya beberapa kilobasa, tetapi pada beberapa organisme, khususnya genus Pseudomonas plasmid berukuran lebih dari beberapa ratus kilobasa.

Pengertian Episom

• Selain plasmid, yang akan dibahas pada makalah ini adalah episom.
• Episom merupakan unsur-unsur genetik bebas yang telah dapat berkembang dalam sel bakteri baik dalam keadaan autonom (menggandakan diri dan dipindahkan tanpa bergantung kepada kromosom bakteri) maupun pada keadaan terintegrasi (melekat pada kromosom bakteri, berperan serta bersamanya dalam rekombinasi genetika dan dipindahkan bersama kromosom bakteri tersebut) (Hakim, 2010).

• Pengertian di atas diperkuat oleh Garner (1991) yang menyebutkan bahwa episom merupakan elemen genetik yang memiliki dua alternatif cara replikasi
• Cara replikasi itu meliputi

1. sebagai bagian yang terintegrasi dalam kromosom utama
2. sebagai elemen genetik autonom yang independen (berdiri sendiri) dari kromosom utama.

• Dalam kamus britanica terdapat informasi tambahan bahwa dalam konjugasi bakteri, sel bakteri yang memiliki episom bertindak seolah-olah sebagai ‘pejantan’nya, sebab di dalam proses tersebut terjadi transfer episom atau episom beserta gen yang ditempelinya ke sel yang lain.

Perbedaan Antara Plasmid dan Episom

• Antara plasmid dan episom tidaklah sama, terdapat sebuah perbedaan mendasar diantara keduanya.
• Dalam Wiki.Answer (sebuah forum diskusi ilmiah di internet) menyimpulkan bahwa perbedaan antara plasmid dan episom sebagai berikut;
• Plasmid merupakan molekul DNA ekstra kromosom, plasmid tidak dapat bergabung dengan DNA kromosom, dan plasmid berisi informasi genetik yang diperlukan untuk replikasi plasmid itu sendiri.
• Sedangkan episom adalah setiap jenis DNA ekstra-kromosom yang dapat berhubungan dengan DNA kromosom.
• Episom biasanya lebih besar dari DNA ekstra-kromosom lainnya.
• Contoh episom adalah virus, karena mereka mengintegrasikan materi genetik mereka ke dalam DNA kromosom inang dan bereplikasi bersama dengan replikasi DNA kromosom inangnya.

Fungsi Plasmid dan Episom

• Sebagai komponen genetik extrakromosomal, plasmid memiliki beberapa peranan yang cukup penting, baik bagi bakteri yang memiliki plasmid itu sendiri maupun bagi penelitian di bidang genetika. D
• ale dan Park (2004) menyebutkan bahwa plasmid menyediakan sebuah dimensi ekstra yang penting terhadap fleksibilitas respon organisme terhadap perubahan lingkungan, baik perubahan itu bersifat antagonis atau berlawanan (misalnya kehadiran antibiotik) maupun yang berpotensi menguntungkan atau baik, misalnya ketersediaan substrat baru.

• Beberapa kegunaan plasmid yang lain bagi bakteri seperti: produksi protein yang berfungsi sebagai zat antimikrobial untuk melawan organisme bakteri yang saling berdekatan misalnya Colicin yang diproduksi oleh E. Coli strain tertentu untuk membunuh bakteri E. Coli yang lain; plasmid membawa sifat virulensi bagi bakteri; bakteri-bakteri tertentu seperti Agrobacterium tumefaciens membawa plasmid yang disebut TI (Tumor Inducing) yang bersifat patogen yang menyebabkan tumor pada tumbuhan dan Rhizobium yang membentuk nodul pada akar kacang-kacangan yang berguna untuk fiksasi nitrogen dikontrol oleh gen-gen yang dibawa oleh plasmid. Selain itu juga, plasmid membawa gen-gen yang digunakan oleh beberapa bakteri dalam aktivitas metabolisme seperti fermentasi laktose dan proses biodegradasi dan bioremidiasi.

• kondisi lingkungan Secara umum, plasmid memiliki peran penting di dalam menberikan kemampuan adaptif yang kuat bagi bakteri. Sesuai dengan sifat plasmid yang dapat keluar atau masuk ke dalam sel bakteri, hal ini memungkinkan bakteri dapat memiliki sifat-sifat genetik dan juga sifat-sifat metabolis yang menguntungkan pada yang baru.

• Dari segi penelitian genetika, plasmid telah lama dikenal sebagai vektor dalam teknik rekayasa genetika. Contoh yang cukup popular adalah bakteri penghasil insulin, bakteri ini dihasilkan dengan menanamkan plasmid yang telah di modifikasi dengan disisipi gen pengkode insulin, dengan memiliki plasmid tersbut, bakteri itu mampu memproduksi insulin. Selain itu masih banyak contoh-contoh lain terkait manfaat plasmid di bidang penelitian genetika.

• Sedikit berbeda dengan pada plasmid, umumnya episom justru merugikan sel inang, terutama jika episome tersebut merupakan virus. Sebagaimana kita ketahui pada daur replikasi virus, saat materi genetik virus tersebut masuk ke dalam sel inang dan segera menyisip pada kromosom inti kemudian mengambil kendali sel inang sehingga akhirnya membentuk virion-viron baru. Tentu saja proses ini merugikan bagi sel inang, apalagi jika daur tersebut berakhir dengan lisisnya sel inang.

• Namun beberapa episom virus ternyata diketahui dapat berada dalam kondisi dorman (viral episomal latency), sebagaimana yang disebutkan di dalam wikipedia (2011) bahwa viral episomal latency merupakan kondisi dimana materi genetik virus yang telah masuk ke dalam sel inang, hanya melayang-layang (floating) di dalam sitoplasma sel inang. Dalam kondisi ini episom virus tersebut tidak memberikan bahaya yang serius bagi sel inang.

• Dalam bidang rekayasa genetika, episome memberikan manfaat yang cukup besar. Seperti halnya plasmid episom seringkali digunakan untuk menyuntikkan gen-gen tertentu ke dalam kromosom sel target sehingga, dengan demikian sel target akan memiliki sifat-safat yang dibawa gen tadi. Dalam hal ini, penggunaan episom memberikan hasil yang sedikit berbeda dengan plasmid, dimana gen yang disuntikkan akan bergbung bersama pada DNA utama pada sel target.

Struktur Serta Replikasi Plasmid dan Episom

• Plasmid memiliki bentuk sirkular dan melakukan replikasi sendiri.
• Plasmid berada di dalam sel dan replikasinya seperti replikasi DNA seluler.
• Plasmid merupakan DNA yang membawa sejumlah gen. sedikit berbeda dengan plasmid,

• Episom merupakan materi genetik ektra kromosomal yang dapat menyisip pada kromosom utama sel induk.
• Secara struktur episom bergabung dan menyatu dengan kromosom sel induk.
• Plasmid pada E.Coli terdiri atas dua tipe yaitu tipe pertama disebut ColE1
• ColE1 berukuran relatif kecil (kurang dari 10 kb) dan terdapat dalam kopian berganda di dalam sel
• Kelompok plasmid kedua digolongkan ke dalam plasmid F yang berukuran lebih besar (lebih besar dari 30 kb; plasmid F sendiri berukuran 100 kb).
• Plasmid ini hanya memiliki satu atau dua kopian per sel
• Plasmid ini juga dikenal dengan plasmid konjugatif.

• Replikasi plasmid tipe pertama tidak berhubungan dengan proses replikasi kromosomal dan pembelahan sel (oleh sebab itu memiliki jumlah kopian yang banyak), meskipun ada beberapa pengontrol dalam replikasi plasmid.
• Sedangkan plasmid tipe kedua, replikasinya dikontrol dengan cara yang sama seperti pada kromosom.
• Karenanya, ketika kromosom diinisiasi untuk bereplikasi, maka replikasi plasmid ini pun akan terjadi. Oleh karena itu plasmid tipe ini tidak bisa diamplifikasi (perbanyakan).
• Struktur plasmid ColE1. imm: gen untuk memproduksi colicin E1 dan imunitasnya; mob: gen yang mengkode nuklease untuk mobilisasi; rom: gen yang mengkode protein yang dibutuhkan untuk efektivitas jumlah kopian; oriT: origin of conjugal tansfer; oriV: origin of replication. (Gutman, 2004)

1, plasmid dengan jumlah kopian berganda dengan pembagian acak.

2, plasmid dengan jumlah kopian sedikit dengan pembagian terarah.

• Model replikasi plasmid sama dengan kromosom (Gambar 2.3).
• Banyak plasmid direplikasi sebagai molekul sirkular untai ganda.
• Replikasi dimulai dari titik yang disebut oriV (vegetative origin, yang membedakannya dengan titik transfer konjugative yaitu oriT) dan prosesnya berasal dari titik ini dalam satu maupun dua arah secara simultan sampai seluruh lingkaran dikopi.
• Replikasi pada plasmid untai tunggal terjadi pada beberapa bakteri seperti bakteri gram positif yang memiliki plasmid untai tunggal.
• Model replikasi plasmid untai tunggal dapat dilihat pada gambar berikut.
• Berawal dari untai tunggal yang disebut untai (+) disitensis untai komplementer yaitu untai (-) membentuk untai ganda (formasinya disebut RF).
• Dari bentuk RF kemudian disintesis kopian plasmid untai tunggal. Siklus berlanjut dan membentuk untai tunggal berikutnya.

• Plasmid juga memiliki bentuk liner seperti yang dicirikan pada beberapa genus bakteri yaitu Borrelia dan Streptomyces.
• Replikasi berawal dari bagian oriC (origin of replication central) membentuk struktur dimerik sirkular.
• Struktur dimerik sirkular dipotong, sehingga menghasilkan satu plasmid linier yang baru.

• Pemotongan akurat terjadi pada bagian yang sama, tetapi rekombinasi dengan bagian kromosom yang berbeda menghasilkan penggabungan DNA kromosom (pada kasus ini gen lac) ke dalam plasmid (d-e) membentuk sebuah plasmid F’ dan menyebabkan delesi kromosom.

PRAKTIKUM PERECOBAAN SPALLAZNI

A.   Waktu dan Tempat Praktikum

Hari/Tanggal :

Waktu           :

Tempat         : 

Kelompok :

B.   Alat Dan Bahan Alat     :

1.      3 buah tabung reaksi

2.      1 buah rak tabung reaksi

3.      2 buah sumbat gabus

4.      1 buah lampu spritus

5.      1 buah klem kayu

6.      1 gelas aqua plastik/ gelas Kimia

7.      Gelas ukur

8.      Corong/ pipet

Bahan :

1.      40 ml kaldu

2.      1 potong lilin

3.  lampu spiritis

4.      Korek api

C.   Prosedur Kerja

1.      Mengisi ketiga tabung reaksi dengan kaldu masing-masing tempat 10 ml.

2.    Menutup tabung I dengan sumbat gabus. Lalu meneteskan lilin cair pada sela antara mulut tabung dengan 3.      Mendidihkan kaldu pada tabung II dengan lampu spiritus selama 10 menit lalu membiarkannya terbuka.

4.     . tutup  Mendidihkan kaldu pada tabung III  dengan lampu spiritus selama 10 menit, kemudian menutup tabung reaksi dengan sumbat gabus. Lalu meneteskan lilin cair pada selama antara mulut tabung dengan tutup.

6.      Meletakkan semua tabung di dalam gelas aqua dan menyimpannya di atas meja (tempat yang aman dan tidak terkena cahaya matahari, dan sumber panas lainnya).

7.      Melakukan pengamatan dan pencacatan selama 6 hari berturut turut.

 Hasil Pengamatan

Table 1.1.  Hasil  pengamatan air kaldu selam 6 hari

NO	TABUNG	HARI							KETERANGAN
		1	2	3	4	5	6	7
1	I
2	II
3	III

Keterangan : (- ) = tidak keruh

                     ( +) = keru/ ada mikroba pengurai

Gambarlah hasil percobaan:

1.     Tabung I    (tertutup, tidak dipanasi)

2.     Tabung II   (tidak tertutup, dipanasi)

3.     Tabung III  (tertutup, dipanasi )

B.   Pembahasan

1.      Tabung I (tertutup, tidak dipanasi)

....................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

2.      Tabung II (tidak tertutup, dipanasi)

....................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

3.      Tabung III (tertutup, dipanasi)

...........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

Pertanyaan :

1.      Bagaimanakah pendapat Lazzaro Spallanzami tentang asal usul kehidupan.?

2.      Dari mana mikroba yang ada di tabung no.1 dan 2..Jelaskan

3.      Menmgapa tabung no. 3 tetap bening. Jelaskan

A.    Kesimpulan ........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

Evolusi

         Evolu berarti perubahan pada sifat-sifat terwariskan suatu populasi organisme dari satu generasi ke generasi berikutnya. Perubahan-perubahan ini disebabkan oleh kombinasi tiga proses utama: variasi, reproduksi, dan seleksi. Sifat-sifat yang menjadi dasar evolusi ini dibawa oleh gen yang diwariskan kepada keturunan suatu makhluk hidup. Sifat-sifat ini bervariasi dalam suatu populasi. Ketika organisme bereproduksi, keturunannya akan mempunyai sifat-sifat yang baru. Sifat baru dapat diperoleh dari perubahan gen oleh mutasi ataupun transfer gen antar populasi dan antara spesies. Pada spesies yang bereproduksi secara seksual, kombinasi gen yang baru juga dihasilkan oleh rekombinasi genetika, yang dapat meningkatkan variasi antara organisme. Evolusi terjadi ketika perbedaan-perbedaan terwariskan ini menjadi lebih umum atau langka Terdapat dua mekanisme utama yang mendorong evolusi. Yang pertama adalah seleksi alam, merupakan sebuah proses yang menyebabkan sifat terwaris yang berguna untuk keberlangsungan hidup dan reproduksi organisme menjadi lebih umum dalam suatu populasi, sebaliknya sifat yang merugikan menjadi lebih berkurang. Hal ini terjadi karena individu dengan sifat-sifat yang menguntungkan lebih berpeluang besar bereproduksi, sehingga lebih banyak individu pada generasi selanjutnya yang mewarisi sifat-sifat yang menguntungkan ini. Setelah beberapa generasi, adaptasi terjadi melalui kombinasi perubahan kecil sifat yang terjadi secara terus menerus dan acak ini dengan seleksi alam. Mekanisme utama kedua adalah hanyutan genetika (Bahasa Inggris: Genetic Drift), merupakan sebuah proses bebas yang menghasilkan perubahan acak pada frekuensi sifat dalam suatu populasi. Hanyutan genetika dihasilkan dari probabilitas apakah suatu sifat akan diwariskan ketika suatu individu bertahan hidup dan bereproduksi. Walaupun perubahan yang dihasilkan oleh hanyutan dan seleksi alam kecil, perubahan ini akan terakumulasi, menyebabkan perubahan yang substansial pada organisme. Proses ini mencapai puncaknya dengan menghasilkan spesies yang baru. Dan sebenarnya, kemiripan antara organisme yang satu dengan organisme yang lain mensugestikan bahwa semua spesies yang kita kenal berasal dari nenek moyang yang sama melalui proses divergen yang terjadi secara perlahan ini.
Biologi evolusioner mendokumentasikan fakta bahwa evolusi terjadi, dan juga mengembangkan dan menguji teori-teori yang menjelaskan penyebabnya. Kajian catatan fosil dan keanekaragaman hayati organisme-organisme hidup telah meyakinkan para ilmuwan pada pertengahan abad ke-19 bahwa spesies berubah dari waktu ke waktu. Namun, mekanisme yang mendorong perubahan ini tetap tidaklah jelas sampai pada publikasi tahun 1859 oleh Charles Darwin, On the Origin of Species yang menjelaskan dengan detail teori evolusi melalui seleksi alam. Karya Darwin dengan segera diikuti oleh penerimaan teori evolusi dalam komunitas ilmiah. Pada tahun 1930, teori seleksi alam Darwin digabungkan dengan teori pewarisan Mendel, membentuk sintesis evolusi modern, yang menghubungkan satuan evolusi (gen) dengan mekanisme evolusi (seleksi alam). Kekuatan penjelasan dan prediksi teori ini mendorong riset dengan terus menerus menimbulkan pertanyaan baru, dan ia telah menjadi prinsip pusat biologi modern yang memberikan penjelasan secara keseluruhan keanekaragaman hayati di bumi.
Meskipun teori evolusi selalu diasosiasikan dengan Charles Darwin, namun sebenarnya biologi evolusi telah berakar sejak jaman Aristoteles. Namun demikian, Darwin adalah ilmuwan pertama yang mencetuskan teori evolusi yang telah banyak terbukti mapan menghadapi pengujian ilmiah. Sampai saat ini, teori Darwin tentang evolusi yang terjadi karena seleksi alam dianggap oleh mayoritas masyarakat sains sebagai teori terbaik dalam menjelaskan peristiwa evolusi dalam suatu populasi.

PERMASALAHAN TENTANG CATATAN FOSIL
Ketika Darwin mengemukakan teorinya, para ahli paleontologi adalah yang paling menentangnya. Mereka mengetahui bahwa "bentuk-bentuk peralihan" yang diduga pernah ada oleh Darwin, kenyataannya tidak pernah ditemukan. Darwin berharap permasalahan ini akan dapat teratasi dengan penemuan-penemuan fosil baru. Akan tetapi, ilmu paleontologi malah semakin menggugurkan teori Darwin hari demi hari.

FOSIL MAKHLUK HIDUP

Tidak terdapat perbedaan antara fosil makhluk hidup berusia ratusan juta tahun yang lalu dengan kerabatnya yang masih hidup sekarang. Fakta ini sama sekali mematahkan pernyataan evolusi.

FOSIL LEBAH
Fosil lebah berumur 60 juta tahun; tidak berbeda dengan lebah zaman sekarang.

IKAN

Fosil ikan berumur 200 juta tahun (kanan) menunjukkan bahwa ikan purba dan kerabat modernnya tidaklah berbeda satu sama lain.

Darwin mengemukakan pernyataannya bahwa manusia dan kera berasal dari satu nenek moyang yang sama dalam bukunya The Descent of Man yang terbit tahun 1971. Sejak saat itu, para pengikut Darwin telah berusaha untuk memperkuat kebenaran pernyataan tersebut. Tetapi, walaupun telah melakukan berbagai penelitian, pernyataan "evolusi manusia" belum pernah dilandasi oleh penemuan ilmiah yang nyata, khususnya di bidang fosil.

Kalangan masyarakat awam adalah yang umumnya tidak mengetahui kenyataan ini, dan menganggap pernyataan evolusi manusia didukung oleh berbagai bukti kuat. Anggapan yang salah tersebut terjadi karena masalah ini seringkali dibahas di media masa dan disampaikan sebagai fakta yang telah terbukti. Tetapi mereka yang benar-benar ahli di bidang ini mengetahui bahwa kisah "evolusi manusia" tidak memiliki dasar ilmiah. David Pilbeam, salah satu ahli paleontologi dari Harvard University, menyatakan berikut ini:

Bila anda mendatangkan seorang ilmuwan cerdas dari bidang ilmu lain dan memperlihatkan padanya sedikit bukti yang kita miliki, ia pasti akan berkata, 'lupakanlah: tidak terdapat cukup bukti untuk meneruskannya.